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RD-BIOTECH et DIACLONE au sein d’un même groupe pour une plus grande synergie dans le domaine des anticorps monoclonaux !

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PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX (murins, humanisés, chimériques, de rat)

Depuis plusieurs années, RD-Biotech a développé un savoir faire dans la production in vitro d’anticorps monoclonaux. La production en ascites, toujours autorisée en France, est reconnue comme très pénible pour les animaux et elle peut aujourd’hui être avantageusement remplacée par culture cellulaire.
Avec son unité de production in vitro, RD-Biotech propose des technologies alternatives à un coût équivalent aux productions en ascites et ce avec une reproductibilité et une qualité de pureté bien supérieures aux productions en ascites.

Lorsque le client confie son clone à RD-Biotech (flasques ou cryotubes) pour une production in vitro, il n’est pas nécessaire de préciser la spécificité du clone, ce qui garantit la confidentialité envers le client.

Les différentes étapes d’un projet de production d’anticorps in vitro sont les suivantes :
Le client fournit le clone accompagné d’une fiche technique dans laquelle seront précisés le milieu de culture, la nature et l’isotype de l’anticorps. L’hybridome peut être adapté à différents milieux de culture (sérum déplété en IgG bovines, milieu sans sérum…).

Pour de grandes quantités d’anticorps monoclonaux à produire (au-delà de 100 mg, RD-Biotech propose une évaluation de la productivité sur de petits volumes.

A l’issue de cette faisabilité, le client reçoit un rapport indiquant la productivité obtenue in vitro et un devis précis et ferme pour la phase production. Il peut recevoir également l’anticorps pour l’évaluer avant de commander la phase production in vitro.
RD-Biotech démarre ensuite la phase production in vitro sur des volumes pouvant aller de 1 litre à plus de 100 litres de surnageant de culture, ce qui permet de produire de quelques mg à plusieurs grammes d’anticorps in vitro.

- Suivi de production :
Grâce aux kits de dosage des IgG de souris, IgG de rat et IgG humaines développés et commercialisés par RD-Biotech, nous pouvons suivre la production des anticorps dans le surnageant de culture afin d’estimer très rapidement la quantité de surnageant à produire pour atteindre l’objectif défini.

- Purification (Immunoglobulines G, M ou A) :
Le surnageant produit peut être ensuite concentré jusque 15 fois par ultrafiltration tangentielle avant de procéder à la purification de l’anticorps monoclonal. La purification de l’anticorps monoclonal est réalisée par chromatographie d’affinité sur Protéine A ou Protéine G selon l’origine ou l’isotype du clone. Dans le cas d’immunoglobulines M, la purification est réalisée par chromatographie échangeuse d’ions.

En option, l’anticorps produit in vitro peut être purifié en conditions Endofree, ce qui nécessite l’usage de tampons et contenants apyrogènes.

Après l’étape de chromatographie d’affinité, la pureté de l’anticorps peut être améliorée par une étape de chromatographie d’échange d’ions, qui élimine également les endotoxines éventuellement présentes. Les anticorps monoclonaux produits in vitro par RD-Biotech en conditions Endofree ont un taux d’endotoxines inférieur à 1 EU/mg.

Les anticorps monoclonaux produits in vitro peuvent être livrés au client après concentration et équilibrage dans le tampon de son choix.

- Contrôle Qualité :
Les anticorps monoclonaux produits in vitro par RD-Biotech sont livrés avec un rapport de contrôle qualité incluant un contrôle par électrophorèse (SDS-PAGE) un dosage des protéines totales et éventuellement un test LAL qui permet de déterminer le taux d’endotoxines bactériennes. Le test LAL (Limulus Amebocyte Lysate) est réalisé à l’aide d’un kit réglementaire selon le protocole du fournisseur. Si nécessaire, contrôle supplémentaire par HPLC.

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DEVELOPPEMENT D'HYBRIDOMES MURINS

RD-Biotech propose de prendre en charge vos projets d’anticorps monoclonaux.

-Le client fournit : la protéine d’intérêt, native ou recombinante, ou une séquence peptidique sur fichier informatique.

- RD-Biotech prend en charge la stratégie d’immunisation en immunisant entre 5 et 10 souris selon les projets.

- La réponse immunitaire est ensuite suivie par titration ELISA ou Western-blotting.

- La fusion cellulaire est réalisée après validation des résultats de titration par le client.

- Criblage : plusieurs types de criblage peuvent être envisagés, ELISA, Western-blotting, cytométrie de flux ou autres méthodes.
Après criblage, les hybridomes positifs sont repiqués pour contrôle secondaire et amplification de sauvegarde.

- Les hybridomes positifs sont ensuite clonés par deux cycles de dilution limite.

- Sauvegarde : Les hybridomes positifs sont sauvegardés par constitution de banque maitresse dès que possible.

- Développement et production d'anticorps polyclonaux
RD-Biotech développe des anticorps polyclonaux à façon à partir de différents types d’immunogènes (protéine purifiée, peptide, lysat cellulaire…).
L’espèce la plus utilisée est le lapin, mais nous avons la possibilité également de développer des anticorps de poule (IgY).

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BANQUES CELLULAIRES

Réalisation de banques (Master et Working banks) et gardiennage

RD-Biotech réalise à façon des banques de sauvegarde des hybridomes des clients.
Le client fournit l’hybridome en culture ou en cryotube.
Les cellules sont amplifiées et si nécessaire, un test de productivité peut être réalisé avec le Kit FastELISA .

Les cellules sont congelées en phase de croissance exponentielle avec une viabilité de 100%.
Les cryotubes sont ensuite congelés à -80°C et à l’azote avant expédition chez le client.

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PURIFICATION DES IMMUNOGLOBULINES : IgG, IgM, IgA, IgY

Le client fournit du sérum, du plasma, du surnageant de culture, du jaune d’œuf.

Grâce à la technique FastELISA de dosage des IgG de souris, des IgG de rat ou des IgG humaine, RD-Biotech peut contrôler très rapidement le taux d’immunoglobulines G dans l’échantillon et estimer la quantité qu’il sera possible de purifier.

RD-Biotech réalise la purification des anticorps par des méthodes robustes assurant une excellente qualité des anticorps purifiés.
Contrôles qualité : Les anticorps purifiés par RD-Biotech sont livrés avec un rapport de contrôle qualité incluant un contrôle par électrophorèse (SDS-PAGE) un dosage des protéines totales.
Les anticorps purifiés sont ensuite expédiés chez le client avec un rapport de purification complet.

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COUPLAGE ET AUTRES MODIFICATIONS

RD-Biotech réalise la fragmentation de l’anticorps monoclonal ou de l’anticorps polyclonal (pepsine, papaïne…) et/ ou le couplage des anticorps par différents marqueurs :

- marquage par Peroxydase (HRP)
- marquage par Phosphatase alcaline (PAL)
- marquage par Biotine
- marquage par un marqueur fluorescent (Fluoresceine FITC, Cyanine, Alexa fluor …)
- marquage par billes type Luminex

Les couplages sont réalisés selon des protocoles robustes, pratiqués en routine par nos équipes.
Après modification de l’anticorps et contrôle qualité, l’échantillon est expédié chez le client accompagné d’un rapport.

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DEVELOPPEMENT D'IMMUNO-ESSAIS

ELISA, Western-Blotting, Cytométrie de flux, …

RD-Biotech met à disposition son expertise pour le développement ou la réalisation en série de méthodes d’immuno-dosages grâce à sa plate forme d’immuno-analyse.

-Développement de méthodes analytiques à partir du cahier des charges du client.
-Analyse des échantillons du client à partir d’une méthode validée par le client.

Pour des applications variées :
-Diagnostic in vitro animal et humain
-Contrôles qualité
-Recherche
-Etudes cliniques

-ELISA : Développement de méthodes
RD-Biotech peut prendre en charge le développement d’une méthode ELISA, basée sur le cahier des charges du client.
RD-Biotech réalise dans un premier temps une étude de faisabilité qui va permettre de déterminer la faisabilité de la méthode ELISA : choix des anticorps et matières premières, mise au point et optimisation des différentes étapes (exemple coating des microplaques, révélation, …), choix de la stratégie :

-TEST 1 : Test en simple sandwich indirect : puits coatés par la protéine purifiée ou un extrait la contenant, révélation avec un anticorps polyclonal commercial ou obtenu par immunisation d'un lapin, révélation par un conjugué anti-espèce couplé à la péroxydase.
-TEST 2 : Test par immuno-compétition : puits coatés par l'anticorps spécifique, incubation d'un mélange de protéine marquée par la péroxydase, avec la protéine purifiée non marquée.
-TEST 3 : Test en double sandwich indirect ou direct (selon les disponibilités en anticorps spécifiques) : coating par l'anticorps 1, incubation par la protéine purifiée ou non, incubation par le deuxième anticorps, révélation de l'activité péroxydase en direct (si l'anticorps 2 est conjugué) ou indirect avec un anticorps anti-espèce.
Différents paramètres sont étudiés dans ces différentes stratégies, afin d’optimiser les conditions de coating des micro-puits, d’incubation des échantillons, de révélation…
Traitement des données : Toutes les mesures d'absorbances sont enregistrées sous forme de fichiers BPL et Excel afin de pouvoir être analysées. Les données sont consignées dans un cahier paillasse, qui sera remis au client sur sa demande.

A l’issue de cette première étape, RD-Biotech est en mesure de préciser la meilleure méthodologie à utiliser, en précisant les conditions de fonctionnement les plus prometteuses du test. Dans le rapport, RD-Biotech fournit un ensemble de courbes de dosage réalisées dans des conditions variées (volume prise d'essai, nombre et durée d'incubation, conjugué enzymatique) ainsi qu'un protocole transférable décrivant l'ensemble des protocoles d'utilisation.

Le client peut alors décider de lancer l’étape de développement d’une méthode ELISA robuste transférable chez le client.


- Service analytique à RD-Biotech : ELISA, Western-Blotting, cytométrie de flux, BIACORE,…
A partir des échantillons fournis par le client, RD-Biotech prend en charge l’analyse des échantillons, à partir d’une méthode validée par le client ou à partir de trousses commercialisées.
A l’issue des analyses, RD-Biotech fournit des données brutes et un rapport d’analyses au client.

Types d’analyses réalisées :

- Titration de réponses immunes par ELISA
- Typage de réponses immunes par ELISA ou Western-Blotting multi pistes (système multiscreen)
- Détection de particules virales
- Dosage de marqueurs protéiques types cytokines … dans différents types d’échantillons (plasma, surnageant de culture, fluide biologique…) par ELISA
- Caractérisation d’intéractions moléculaires (constantes cinétiques, constantes d’affinité..) par Biacore
- Dosage de molécules fonctionnelles par Biacore
- Tri cellulaire par cytométrie de flux

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SERVICES COMPLEMENTAIRES

Notre équipe commerciale ainsi que nos experts scientifiques et techniques sont à votre écoute pour vous proposer le service adapté à votre demande!

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PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX (murins, humanisés, chimériques, de rat)PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUXPRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX (murins, humanisés, chimériques, de rat)DEVELOPPEMENT D'HYBRIDOMES MURINSDEVELOPPEMENT D'HYBRIDOMES MURINSDEVELOPPEMENT D'HYBRIDOMES MURINSPURIFICATION DES IMMUNOGLOBULINES : IgG, IgM, IgA, IgYPURIFICATION DES IMMUNOGLOBULINES : IgG, IgM, IgA, IgYCOUPLAGE ET AUTRES MODIFICATIONSPlasmide resultats gel ADN orangePlasmide resultats gel ADN orangePlasmide resultats gel ADN orange